万源盛科技有限公司-食品安全检测试剂盒,动物源性食品中兽药,抗生素残留检测试剂盒,霉菌毒素类金标快速检测卡
试剂盒操作流程和注意事项
发布时间:2015-7-20    浏览次数:
试剂盒的相关知识
一.了解食品安全问题
 从双汇‘‘瘦肉精事件’’联想到的
 
二.了解非法添加物
平喘药,一类动物用药,增加瘦肉量,降低成本,导致心脏病,引发恶性肿瘤
其它非法添加物
三聚氰胺,氯霉素,链霉素,黄曲霉毒素B1,磺胺类,氟奎诺酮类,呋喃类,地塞米松,喹乙醇代谢物,金刚烷胺,氟苯尼考,甲砜霉素,替米考星,四环素等。
三.如何检测它们?
胶体金卡:肉眼判断,定性检测
ELISA试剂盒:需要实验室和专业人员,定量检测
此外,还有理化方法:高效液相色谱,气相色谱等
四.了解抗原和抗体
抗原:抗原是指进入人或动物机体后,可刺激机体免疫系统发生免疫应答,从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞,并能和抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。
抗体:是由抗原刺激动物的免疫系统后,由免疫系统产生分泌的能和相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。
抗原抗体的基本特性:a、反应的特异性;b、反应的等比例性
五.了解ELISA方法
ELISA方法简介:
ELISA属于标记免疫学技术的一种,1971年由荷兰和瑞典的学者提出,由于其操作过程简单易行并可以定量,从而使其在食品安全和卫生检测中得到了广泛的应用。目前市场上有多种基于ELISA方法开发的用于食品中抗生素检测的试剂盒产品。
 
六.常用ELISA原理及分类
  
 
七.ELISA试剂盒直接竞争一步法原理(包被抗体)
 
 
 
八.ELISA试剂盒间接竞争两步法原理(包被抗原)
Elisa检测小分子的原理:
     样品中的抗原与包被抗原竞争加入的一抗,一部分一抗与样品中的抗原结合,另一部分一抗与包被的抗原结合后被固定在酶标板板孔内,通过洗板洗掉未与包被原结合的一抗,再加入酶标二抗,酶标二抗与固相化的一抗反应,再次洗板,洗掉多余的酶标二抗,加入TMB底物后显色。
 
九.一步法和两步法优劣
    一步法有包被抗体,也有包被抗原。一步法原理是直接竞争法,反应时间短,但相对反应复杂,稳定性差。
     两步法包被抗原,第一步加样品或校准品和抗体,第二步加酶工作液,反应时间长,但相对稳定。
 
十.ELISA试剂盒性能指标
灵敏度
 
精密度:CV%衡量
              
准确度:回收率衡量,如何计算回收率?
  添加前的阴性样品设为样品A,添加后的样品设为样品B,将A和B同时进行检测,其检测结果分别为CA、CB.    回收率=(CB— CA)/添加浓度×100%
其它性能指标:
稳定性:    2-8℃有效期一年
           (37 ℃烘烤一周)
线性范围:  检测出的浓度范围
特异性:    交叉反应率衡量
 
十一.试剂盒组份
校准品:试剂盒的标尺
抗体工作液 
酶工作液
底物:分A和B
终止液:2mol/L硫酸
洗液:有去离子水和浓缩洗液2种
浓缩复溶液
酶标板:包被抗原或抗体,有COSTAR和JCH两种,均96孔。
 
十二.样品前处理
样品中除待测物外一切组分叫基质。
前处理就是样品制备,解决基质效应的过程。
方法:有机试剂分层处理,水溶性的有机溶剂溶解基质物。
 
十三.ELISA操作程序(一步法)
1. 回温:将所需试剂平衡至室温。
2.加标品/样品:先将校准品或样品每孔50uL加到微孔中
3.加酶和抗体:再于每个微孔中另再加入50uL 酶结合物和抗体工作液的混合液
4.孵育:用封板膜封板,轻轻振荡混匀,25℃环境反应30分钟
5.洗板:取出微孔板,甩干拍干,用洗液洗板,250uL每孔洗板4次,每次浸泡30秒,洗完拍干。
6.显色:每一微孔加入底物A溶液50uL,再加底物B溶液50uL,轻轻振荡混匀,使其充分混合。 
7.避光反应:用封板膜封板,25℃环境避光反应15分钟
8.加终止液:加入反应终止液,每一微孔加入50mL,轻轻振荡。
9.测定:设定酶标仪双波长450/630nm处检测,测定OD值。
 
 
十四.样本浓度的计算
 
所获得的每个浓度标准溶液或样本吸光度值的平均值(B )除以第一个标准(O 标准)的吸光度值(B 。)再乘以100 % ,即百分吸光度值。
百分吸光度值(% ) = ( B / BO ) / 100 % 
公式中B 为样本溶液的平均吸光度值,B0为0PPb标准溶液的平均吸光度值。以克伦特罗浓度的半对数值为x 轴,百分吸光度值为Y 轴,绘制标准曲线图,(标准曲线如图)相对应每一个样品中残留的克伦特罗的浓度可以从标准曲线上读出,在实际的计算中只需用酶标测出标准品和样品的吸光值,其他过程可通过专用的计算软件完成。
 
 
十五.IC50是什么? IC50越小,试剂盒性能越好。
什么是OD值?就是吸光度值。被检物浓度和OD值有定量关系。
 
 
 
 
 
 
ELISA操 作 注 意 事 项
 
1、室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温(20-25℃)会导致所有标准的OD值偏低。
2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况,则会出现标准曲线不成线性,重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
3每加一种试剂前需要将其摇匀。
4、反应终止液为2M硫酸,避免接触皮肤。
5、不要使用过了有效日期的试剂盒;也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂,掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。
6、储存条件
保存试剂盒于2-8℃,不要冷冻,将不用的微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感,因此要避免直接暴露在光线下。
7、试剂变质的迹象
发色试剂有任何颜色表明发色剂变质,应当弃之。0标准的吸光度(450/630nm)值小于0.5A450nm<0.5)时,表示试剂可能变质。
8、在加入底物A液和底物B液后,一般显色15min即可。若颜色较浅,可延长反应时间到20min(或更长),但不得超过30min。反之,则减短反应时间。
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